【摘要】

作为生物材料的重要组成部分，胶原蛋白为组织工程中的细胞粘附和增殖提供了三维支架和生物学线索。最初在化脓性链球菌中发现并在异源宿主中产生的重组胶原蛋白样蛋白已被化学和基因工程改造用于生物材料应用。然而，现有的类胶原蛋白不形成凝胶，限制了它们作为生物材料的实用性。

最近，江南大学许菲教授团队提出了一系列合理设计的类胶原蛋白，由三聚化结构域、不同长度的三螺旋结构域和一对作为粘合末端连接到 N 和 C 末端的异源三聚体卷曲螺旋序列组成。这些设计的蛋白质折叠成三重螺旋并形成自支撑凝胶。随着三螺旋域的延长，凝胶变得不那么硬，孔径增加，结构各向异性降低。此外，细胞培养试验证实设计的蛋白质是无细胞毒性的。这项研究为基于胶原蛋白的生物材料提供了一种设计策略。序列变化揭示了蛋白质一级结构和材料特性之间的关系，其中交联密度和结合能的变化定义了蛋白质网络的凝胶化。相关论文以题为Design Strategies to Tune the Structural and Mechanical Properties of Synthetic Collagen Hydrogels发表在《生物大分子》上。

图 1. 蛋白质的设计策略和验证。测试了三种设计：E3-VB-K3、E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3。蛋白质的 (A) 序列和 (B) 二级结构的示意图。(C) 提出的分子间关联和自组装机制。凝胶电泳表征 (D) 用 NcoI 和 BamHI 酶消化重组质粒后核苷酸片段的长度和 (E) 蛋白质的分子量。(F-I) 基质辅助激光解吸电离飞行时间 (MALDI-TOF) 质谱法表征蛋白质的分子量。

图 2. 凝胶结构。(A-D) E3-VB-K3 的凝胶化通过倒置小瓶和镊子操作来测试。冻干后，凝胶的微观结构被切成 (B, C) 纵向和 (D) 横截面，并用扫描电子显微镜 (SEM) 观察。(E-H) E3-VBB-K3 的小瓶倒置测试和 SEM，具有 (F, G) 纵向和 (H) 横截面，以及 (I-L) E3-VBBB-K3，具有 (J, K) 纵向和 (L) 横向横截面。由于 E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3 凝胶的硬度低，它们不能用镊子处理。

图 3. 蛋白质结构和稳定性。(A) CD 波长扫描和 (B) VB、E3-VB-K3、E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3 在 10 mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中 1 mg/mL 的热变性曲线。

图 4. 10 mM 中浓度为 10 mg/mL 的设计胶原蛋白 (A) VB、(B) E3-VB-K3、(C) E3-VBB-K3 和 (D) E3-VBBB-K3 的差示扫描量热法 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。

图 5. 粒度分布。设计的胶原蛋白 (A) VB、(B) E3-VB-K3、(C) E3-VBB-K3 和 (D) E3-VBBB-的流体动力学半径(Rh)分布的动态光散射 (DLS) 测量 K3 超过 48 小时。将样品在 10 mM 磷酸盐缓冲液中保持在 4 °C，浓度约为 1 mg/mL（pH 7.4）。每个子图的插图显示主要 Rh 峰（> 5% 体积强度）随时间的变化。在所有子图中，不同时间的R_h分布曲线如右图所示。

图 6. 微流变学。(A, D) E3-VB-K3、(B, E) E3-VBB-K3 和 (C, F) E3-VBBB-K3 蛋白质溶液在 0.5 时的储存和损失模量 G 和 G  和 1.6% (w/v) 在 10 mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中。顶行显示浓度为 0.5%，底行显示浓度为 1.6% (w/v)，但 E3-VBBB-K3 (F) 显示为 1.16% (w/v) 的饱和浓度。

图 7. 细胞在涂有设计胶原蛋白的板上铺展。将 NIH/3T3 小鼠成纤维细胞接种并铺展在涂有天然 I 型胶原蛋白（阳性对照）、VB、E3-VB-K3、E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3 的组织培养板上，浓度为 1 、10 和 40 μg/mL，持续 24 小时。蛋白质名称和浓度分别标记在图的左侧和顶部。细胞用 CFDA SE 和 Hoechst 染色，并用荧光显微镜观察。比例尺代表所有图像中的 100 μm。

图 8. 由不同 (A) 浓度和 (B) 培养时间的设计蛋白质组成的底物上的相对细胞活力。样品名称标在右侧。测试天然 I 型胶原蛋白（黑色）作为阳性对照。

团队开发了通过蛋白质设计自组织成凝胶的重组胶原蛋白。胶原蛋白使用连接到 Scl2 片段的 α-螺旋粘性末端的嵌合体，重组表达使蛋白质材料的大规模和低成本生产成为可能。这些设计的蛋白质与天然胶原蛋白相比具有几个优点，即批次间的一致性、易于遗传操作，以及可用于承载赋予生物功能（如整合素结合）的序列的模块化设计。细胞培养试验证实凝胶无细胞毒性，使其可用于三维细胞培养。
细胞环境的结构和机械特性影响细胞活力和命运。通过修改蛋白质一级序列，团队可以在嵌合设计中调整材料特性，例如孔径、微观结构的各向异性、凝胶强度和含水量。 E3-VB-K3 形成具有各向异性微观结构的硬凝胶，由均匀的小孔组成。E3-VBBB-K3 形成了均匀的水凝胶，具有更多的多孔微结构和高 (> 98%) 的水含量。此外，观察到的各向异性微结构通常与由分子间相互作用和外力（如磁场和机械拉伸）诱导的聚合物的顺序组装过程有关。团队设计的具有加长三螺旋结构域的胶原蛋白似乎可以提高碰撞概率、加速组装过程并破坏分子的单轴取向。在 DLS 中，E3-VB-K3 随着时间的推移形成稳定的小颗粒和中等尺寸（~60 和~500 nm），而 E3-VBBB-K3 的粒径增加，范围从~300 到~3000 nm。

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